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MeRIP-seq | 豬肌肉和脂肪組織的RNA甲基化組研究
發布日期:2017-11-02瀏覽:
RNA甲基化作為真核生物中最常見的轉錄后修飾,一直未得到廣泛研究。近期研究發現RNA甲基化也是可逆的表觀遺傳修飾,有著重要的生物學功能。因此成為表觀遺傳研究的新熱點,并有多篇相關文章在nature、cell等國際重要期刊上發表。
 
晶能生物與客戶合作,發表2017年最新表觀遺傳學研究文章,通過MeRIP-seq技術首次構建了豬的RNA甲基化譜,并討論了RNA甲基化在肌肉和脂肪組織中的功能。文章發表于BMC Genomics。
 
 
文章摘要 
 
背景:在高等生物中,N6-methyladenosine(m6A)是mRNA最常見的修飾形式??贍嫻膍6A修飾對mRNA的調控作用已經在多個物種被揭示。此外,m6A修飾在不同的組織中會呈現特異的甲基化模式,且會隨著細胞或物種生存環境的變化而改變。然而,迄今為止m6A在豬轉錄水平上的分布及其在脂肪沉積和肌肉發育中的功能還未見報道。
 
方法:在本研究中,我們收集了三個不同豬種(野豬、長白豬、榮昌豬)的肌肉和脂肪組織,并應用methylated RNA immunoprecipitation with next-generation sequencing(MeRIP-seq)技術首次獲得了m6A在豬轉錄水平上的分布圖譜。
 
結果:我們在肌肉和脂肪組織的mRNA中分別得到5872和2826個peaks。這些peaks主要富集在終止密碼子,3’非翻譯區及基因編碼區。GO分析發現核內基因的共有peaks與轉錄因子相關,這表明m6A甲基化與核內轉錄密切相關。一些基因存在組織和物種間的m6A甲基化差異,并且獲得新的生物學功能。此外,我們還發現m6A甲基化程度與轉錄水平密切相關,揭示了m6A對基因表達的調控作用。
結論:這些結果為RNA甲基化修飾在脂肪沉積和肌肉發育中的功能的研究奠定了堅實的基礎。
 
研究背景
 
N6-methyladenosine(m6A)在1970s第一次被發現,是高等生物中mRNA和lncRNA最常見的內部修飾。m6A修飾是由包含兩種甲基轉移酶(METTL3和METTL14)的多成分復合物催化的。這兩種甲基轉移酶形成一個異二聚體與WTAP蛋白相互作用,在體內影響mRNA甲基化的產生。2011年發現兩種m6A去甲基化酶(FTO和ALKBH5)會有選擇的逆轉核內RNA的m6A甲基化。與DNA和組蛋白甲基化類似,這一發現使得RNA甲基化修飾也呈現出可逆的動態變化,并且重燃了對m6A生物學的研究熱情。另外,人類YTH蛋白家族是m6A的reader蛋白,可以特異性的識別m6A修飾的mRNA,并引導其發揮功能。
 
許多研究表明RNA的m6A在細胞代謝過程的調控中起到重要作用。例如,控制哺乳動物胚胎干細胞的細胞命運轉變,調控小鼠干細胞的多能性等。FTO依賴的m6A去甲基化調控mRNA切割,并且是脂肪生成必須的。m6A甲基化在人類疾病中也發揮了重要作用,例如控制HIV-1的復制,在肺癌中促進致癌基因的翻譯等。最新研究表明,m6A介導了果蠅的性別決定,促進了哺乳動物XIST基因介導的轉錄抑制。
 
為了研究RNA甲基化修飾的生物學功能,就需要一種可以在轉錄水平上檢測m6A修飾的方法。2012年,Dominissini等科學家開發出了一種新的測序方法:methylated RNA immunoprecipitation with next-generation sequencing(MeRIP-Seq),可用于轉錄水平上RNA甲基化的檢測,且首次在人類和小鼠中分析了m6A在轉錄水平上的分布。隨著該技術的發展,其他真核生物(酵母,擬南芥,水稻)中也實現了m6A譜的研究。這些研究發現m6A的特點是主要分布于終止密碼子和3’-UTR附近。同時,m6A在外顯子和轉錄起始位點處也有富集,表明m6A可能對轉錄后基因表達調控起到關鍵作用。這些開創性的的研究表明,構建轉錄水平上的m6A甲基化圖譜對揭示m6A修飾的生物學功能有著重要意義。
 
研究思路
 
 
研究結果
 
1. 豬中m6A修飾的檢測
 
我們用MeRIP-seq技術檢測了210日齡長白豬的肌肉(LM)和脂肪(LA)的m6A甲基化。數據過濾后,每個LM樣本獲得超過37400000條高質量序列,而LA樣本得到30600000條高質量的reads(圖1a)。超過70%的reads可以唯一比對到參考基因組。為了減少假陽性率,我們同時檢測了每個組織的input樣本。在LM和LA組中分別有80%和70%的相同peaks可以在生物學重復中檢測到。接下來就用這些高度富集的peaks進一步分析。在LM組中,共檢測到4544個編碼基因的5872個peaks;而在LA中則檢測到2173個編碼基因的2826個peaks(表1和圖1a)。我們通過深入分析得到LM和LA組中每個轉錄本分別包含0.562個peaks和0.254個peaks(圖1b)。
 
為了確定找到的m6A peaks是否包含保守的RRACH (R代表嘌呤,A代表m6A,H為除G以外的堿基)motif,我們進行了motif分析。每個樣本顯著富集的peaks中我們都找到了RRACH保守序列(圖1c)。這些發現使我們分析得到的peaks更加可信。
 
表1 肌肉和脂肪中m6A peaks的統計分布
 
圖1  豬m6A甲基化的概述
 
2. m6A修飾在基因功能元件的分布特征
 
為了理解m6A在轉錄本上的偏好位置,我們研究了peaks在基因功能元件的分布。我們發現peaks在兩個區域出現了劇烈的變化:一個是在5’-UTR終止和CDS起始位點附近;另一個是在CDS終止和3’-UTR起始位點附近。并且CDS終止位點附近的peaks要顯著多于CDS起始位置(圖2a)。為了更好的分析peak的富集情況,我們將peak比對到6個不同的轉錄元件:5’-UTR,起始密碼子,CDS,終止密碼子,3’-UTR及其他。結果發現大部分peaks分布在基因區域內,并且有超過60%的peaks富集在終止密碼子和CDS附近(圖2b)。這些結果在所有樣本中趨勢一致,表明m6A甲基化分布具有一定的保守性。
 
圖2  豬轉錄本上m6A甲基化的分布
 
3. RNA甲基化關聯基因參與重要的生物學功能
 
為了進一步研究m6A甲基化在動物組織發育中的功能,我們找到了不同樣本的共有peaks,并關聯到相應基因。我們共鑒定到1957個共有peaks(圖1a),并關聯到1615個編碼基因。GO分析表明,編碼這些基因的mRNA主要富集在核內,且與多種細胞功能相關,例如:蛋白結合,核酸結合,轉錄因子活性等(圖3a)。隨后我們將甲基化關聯基因分為四個亞組:PeakStart,PeakStop,PeakBoth和其他,并對這些亞組進行GO富集分析。所有的亞組都能富集到與細胞核相關的GO功能,并且有超過48%的基因屬于PeakStop亞組(圖3c)。接下來我們對PeakStop亞組里的基因進一步分析。結果發現大部分基因編碼轉錄因子,表明m6A修飾與轉錄調控相關。例如,我們的數據顯示CREB和ZNF基因的終止密碼子附近存在明顯的peaks(圖3d)。綜上,這些結果證明mRNA甲基化與細胞核內的轉錄密切相關。
 
圖3  共有peak關聯基因的功能分析
 
4. m6A修飾參與不同組織間的差異調控
 
除了共有peaks外,不同組間還存在組織特異性peaks。我們共鑒定到3915個LM特異性peaks,869個LA特異性peaks(圖1a)。這些peaks分別關聯到了3034和562個組織特異性甲基化基因(TSMG)。GO分析結果表明,LM組的TSMG主要與能量調控的信號通路相關,如胰島素信號通路及AMP激活蛋白激酶通路等。而LA組的TSMG主要與脂肪酸代謝和系統發育等功能相關。我們m6A-IP的結果表明,LM組的胰島素信號通路中Irs1和Foxo1基因的5’-UTR,終止密碼子和CDS存在peaks的富集,而LA組中沒有(圖4b)。隨后,我們根據MAnorm模型尋找組間存在顯著差異的共有peaks。結果鑒定得到382差異peaks,并關聯到319個差異甲基化基因。GO功能分析發現這些基因與蛋白結合及細胞遷移過程中細胞極性的建立等功能相關(圖4c)。
 
此外,我們同樣分析了不同基因區域差異peaks的富集。結果發現,不管在終止密碼子,起始密碼子還是同時覆蓋這兩個區域,LM組的peaks比LA組明顯要多(圖4e)。GO分析表明組織差異甲基化基因主要富集到細胞核,并且與代謝調控和蛋白結合相關(圖4f)。
 
為了進一步探究m6A甲基化是否能調控基因的表達,我們找到了兩種組織的差異表達基因。結果發現2988個基因在LM組中高表達,3264個基因在LA組中高表達。在LM高表達基因集中,與LA組相比,LM組有更多的基因包含peaks(1012/312)。而在LA高表達基因集中,LA組包含peaks的基因卻比LM組少(495/581)(圖4g)。這些結果表明,每種組織都有其特定的m6A甲基化水平,并與基因激活相關。
 
圖4  不同組織差異甲基化基因的功能分析
 
 
5. 不同豬種間的m6A修飾
 
為了應對環境變化和遺傳背景的差異,m6A介導的基因調控可能存在物種間的差異。為此,我們進行了不同豬種間的m6A分析,并探究了其修飾的生物學功能。我們對遺傳背景不同的三個豬種(野豬WB、長白豬LD、榮昌豬RC)的肌肉組織進行了MeRIP-seq測序,結果得到了約6500-7500個peaks,且WB組甲基化水平最高,RC組甲基化水平最低。隨后我們對三個豬種間的m6A甲基化進行差異分析,鑒定了物種特異的甲基化peaks及其關聯基因(BSMGs)。在WB和LD組間,分別得到了2155和1843特異性peaks,關聯到2846個BSMGs。同樣,在WB和RC組間我們發現了2510和1912個特性peaks,關聯了3186個BSMGs。而RC和LD組間分別鑒定到1709和1432個peaks,并關聯到2285個基因。GO分析結果表明,這些BSMGs主要與轉錄因子結合,細胞代謝過程等基本的生物學功能相關。
 
接下來,我們根據MAnorm模型尋找兩組間存在甲基化差異的共有peaks,并將這些peaks關聯到包含甲基化差異的基因(BDMGs)。首先,在WB和LD組間我們找到219個差異peaks,關聯到了171個BDMGs。GO分析表明這些基因富集在細胞外基質,且與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,磷酸轉移酶活性等功能相關(圖5a)。例如,與WB組相比,LD組MAP3K14 基因(一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的3’-UTR附近存在顯著的peaks富集(圖5d)。其次,我們在WB和RC組間發現了296個差異peaks,關聯到240個BDMGs。這些基因也顯著富集在胞外基質,并且與受體結合,粘多糖結合及心血管系統的發育相關(圖5b)。最后,我們在RC和LD組間找到了112個共有差異peaks,關聯到89個BDMGs,并進行了GO 分析。結果表明,這些基因主要富集在生物素結合,生物素蛋白連接酶活性,腦信號蛋白受體活性等功能(圖5c)。此外,我們的測序結果表明,RC組的HLCS基因(一種催化生物素與蛋白結合的酶)5’-UTR附近存在顯著的peaks富集(圖5d)。
 
圖5  不同豬種間差異甲基化基因的功能分析
 
參考文獻:
Tao X, Chen J, Jiang Y, et al. Transcriptome-wide N 6-methyladenosine methylome profiling of porcine muscle and adipose tissues reveals a potential mechanism for transcriptional regulation and differential methylation pattern[J]. BMC genomics, 2017, 18(1): 336.
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