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外顯子測序 | TUBB8基因突變致人類卵子減數分裂阻滯
發布日期:2016-10-19瀏覽:

題目:Mutationsin TUBB8 and Human Oocyte Meiotic Arrest

雜志:New england journal of medicine         IF55.873

合作單位:復旦大學

晶能工作:外顯子測序 


文章導讀

2016年1月21日,復旦大學生物醫學研究院王磊教授及其團隊在國際頂級醫學雜志《新英格蘭醫學雜志》上闡述了導致人類卵母細胞成熟障礙的遺傳機制本工作中的外顯子測序工作由晶能生物完成)。王磊教授一直致力于利用分子遺傳學手段尋找人類生殖疾病相關致病基因,并利用細胞、動物模型對相關基因功能展開深入的研究,在本次研究中,他利用遺傳及功能基因組學手段揭開了人類卵子成熟障礙之謎。

 

摘要:

人類生殖繁衍主要依賴于成熟卵細胞和精子融合形成的受精卵,但是阻滯人卵細胞成熟的遺傳機制至今未知。研究人員利用外顯子組測序技術對不孕癥患者四代家系中的5名成員進行研究,其中3名患者因卵母細胞第一次減數分裂受到抑制而導致不孕。接著對這5名患者及家系中的其他成員,加上另外23個患病家系的DNA樣本,利用sanger測序檢測候選基因TUBB8的突變情況。然后利用RT-PCR技術檢測卵母細胞、早期胚胎、精子細胞和部分組織中的TUBB8和其他β-微管蛋白亞型的表達。α-微管蛋白多肽和β-微管蛋白多肽組裝形成異二聚體,研究人員利用實驗評估TUBB8突變是否影響體外異二聚體組裝、HeLa細胞系中的微管結構、酵母細胞中的微管動力學以及小鼠和人類卵母細胞的紡錘體組裝。

 

結果研究者在靈長類動物特有基因TUBB8中鑒定出7個突變。24個家系中,其中7個家系的卵母細胞第一次減數分裂阻滯是由該基因突變引起。TUBB8在卵母細胞和早期胚胎中特異表達,該基因編碼幾乎所有表達的微管蛋白。TUBB8發生突變影響依賴伴侶蛋白的折疊以及α/β-微管蛋白異二聚體組裝過程,破壞了體外培養細胞的微管表達方式,改變了體內微管動力學,導致紡錘體組裝過程出現嚴重缺陷,進而造成小鼠和人類卵母細胞的發育停滯。

 

最后研究者得出結論,TUBB8突變具有顯性負效應,可破壞微管功能并影響卵母細胞減數分裂紡錘體組裝過程及卵細胞的形成,從而導致女性不孕。

 

研究背景:

處于減數第二次分裂中期的卵母細胞與精子發生融合形成受精卵,人類的生殖繁衍真正開始。人卵母細胞進行減數分裂,在新生的卵巢中卵母細胞周期停滯于減數第一次分裂前期,直至青春期在促黃體激素的刺激下重新開始并進行排卵。卵母細胞停滯在減數第一次分裂前期含有完整的細胞核,被稱為胚泡,在重新獲得減數分裂的能力時胚泡破裂。胚泡破裂后,第一次減數分裂中期通過不對稱分裂產生一個極體和一個卵細胞進入第二次減數分裂。成熟的卵母細胞停滯在第二次減數分裂的中期。對絕大多數的哺乳動物而言,這一階段是能否成功受孕的關鍵。

 

體外受精(IVF)產生的嬰兒占全世界新生兒的1~3%。在卵巢及人體絨毛膜促性腺激素的作用下,部分卵母細胞仍未發育成熟的臨床病例普遍存在,但是卵母細胞全部不能發育為成熟卵細胞被報道的僅有很少幾例,并且造成這種臨床表型的遺傳機制完全未知。

 

實驗方法:

1. 研究對象:24個具有卵子成熟障礙的家系

2. 研究思路:

 

實驗結果展示:

1. 研究人員對一個具有常染色體顯性遺傳模式的四代家系(家系1)進行研究(圖1)。女性患者的配偶為正常健康男性。

圖1   卵母細胞成熟受抑制的不孕患者中TUBB8變異情況及其家系圖

 

2. 患者III-5試圖進行體外受精,結果卵母細胞處于減數第一次分裂中期(表1),即使在體外培養也不能發育為成熟的卵細胞。

 

 表1    7個家系不孕患者中含有TUBB8突變卵母細胞的特征及臨床特征

 

3. 對不孕患者III-4的3個處于減數第一次分裂中期和1個表型不正常的卵細胞注射精子,在顯微鏡下觀察發現,沒有一個卵細胞可形成紡錘體(圖2A和2B)。全外顯子測序分析家系1中的5位成員(3個患者和2個正常),結果鑒定出1個突變位點:TUBB8基因編碼區雜合性錯義突變c.T686C (p.V229A)。TUBB8基因編碼靈長類動物特有的β-微管蛋白亞型。這一突變在家系1中的不孕女性中共分離并且表現為父系遺傳模式(圖1)。 

除此之外,研究人員還在7個臨床表型相似的不孕患者中鑒定出TUBB8另外6個突變位點,具體信息如下:家系2中2位患者(c.G1249A,p.D417N);家系5中的1位患者(c.T1088C,p.M363T);家系6中的1位患者(c.G5A,p.R2K)以及家系7中一位患者(c.G900A,p.M300I),再加上家系3和4中的denovo突變(c.C527T,p.S176L和c.G785A,p.R262Q)(圖1)。分別對家系1、2、3、4和6中不孕患者的處于減數第一次分裂中期的卵母細胞進行免疫染色,結果顯示卵母細胞中的紡錘體要么為非正常狀態,要么檢測不到紡錘體存在(圖2C)。因此,所有的不孕患者均不能生成成熟的處于減數第二次分裂中的卵母細胞。針對不同發育階段的卵母細胞利用特異抗體進行免疫染色,結果證實TUBB8定位于紡錘體中。

 

圖2  卵細胞成熟受抑制的表型

A 正常卵母細胞顯微拍攝圖黑色箭頭標示第一極體,白色箭頭標示紡錘體;B 家系1中不孕患者III-4的卵母細胞顯微拍攝圖觀測不到正常紡錘體及第一極體;C正常卵母細胞及不孕患者的卵母細胞免疫染色圖藍色標示紡錘體,綠色標示DNA

 

為了檢測體內TUBB8突變對微管產生的影響,研究人員將FLAG標記的重組質粒轉染HeLa細胞系。轉染野生型TUBB8的細胞系中,可觀察到組裝正常的微管網絡(圖3A),而轉染突變型TUBB8,不論是正?;故歉咚獎澩?,組裝出的微管均呈現出不正常表型,并且會導致微管網絡的整體缺失。這種缺失表型與預測的可能干擾異二聚體穩定性,β-微管蛋白折疊,或者聚合作用的突變(V229A,S176L,M363T,R2K和M300I)顯著相關。微管組織結構變異表型則由干擾驅動蛋白結合相關的突變(R26Q2和D417N)引起(圖3B)。

 

圖3  HeLa細胞系中TUBB8突變對微管組織產生影響

 

細胞系中轉染野生型及突變型TUBB8,然后進行免疫熒光染色 A 綠色為轉染基因表達情況紅色為內源性微管網絡 B 對圖A中的結果進行定量分析

 

為了確立TUBB8突變和不孕表型之間的必然聯系,研究人員將野生型和突變型的TUBB8 RNA顯微注射小鼠卵母細胞。注射野生型TUBB8 RNA的卵母細胞,在胚泡破裂大約12h后形成正常的成熟卵母細胞,而注射任何一種突變的TUBB8 RNAs導致卵母細胞成熟受到抑制,并且形成畸形的紡錘體。同時,第一極體排除率顯著降低(6-33% vs 61±2.2%)(圖4A)。研究人員將顯微注射的RNA濃度提高(1000ng/ul),結果顯示,高濃度的突變型TUBB8RNA(S176L和 D417N)最終導致紡錘體嚴重甚至徹底受損(圖4B):出現卵母細胞成熟障礙表型。為了進一步驗證TUBB8這一突變效應,研究人員將TUBB8 S176L 和D417N突變型RNAs顯微注射入人類胚泡期的卵母細胞,結果顯示紡錘體的組裝嚴重或者徹底受損(圖4C)。與小鼠卵母細胞用相同方式處理,結果一致。

 

圖4  小鼠及人卵母細胞中表達突變型TUBB8 

A 小鼠卵母細胞中注射TUBB8突變型RNA及野生型RNA后極體排除率比較; B 小鼠卵母細胞中注射突變及野生型TUBB8 胚泡破裂12h后免疫染色圖; C人卵母細胞中注射突變及野生型TUBB8 胚泡破裂16h后免疫染色圖 藍色為染色體  綠色為紡錘體紅色為TUBB8

 

參考文獻:Feng R, Sang Q, Kuang Y, et al. Mutations in TUBB8 and human oocyte meiotic arrest[J]. New England Journal of Medicine, 2016, 374(3): 223-232.

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