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10x單細胞案例解讀 | 單細胞轉錄組測序定位巨噬細胞亞群,并進一步研究巨噬細胞衍生的netrin-1如何影響局灶性MMP3激活
發布日期:2019-03-13瀏覽:

巨噬細胞衍生的netrin-1通過激活血管平滑肌細胞中的MMP3促進腹主動脈瘤的形成

 

腹主動脈瘤的特征是廣泛的細胞外基質碎裂和炎癥,然而這些引發的局部血管損傷機制尚不明確。研究人員在前期工作中已經確認神經突起導向因子(netrin-1),一種具有獨特層粘連蛋白樣結構的神經元,是一種指導白細胞遷移的關鍵化學脈沖蛋白。

本文中,作者基于10x Genomcis ChromiumTM平臺的3’ single cell轉錄組測序,對小鼠腹主動脈瘤組織進行單細胞測序,發現活化的巨噬細胞表達netrin-1。同時,通過一系列的小鼠嵌合體模型證明,netrin-1高表達能激活其受體neogenin-1,從而增強MMP3的催化活性。而MMP3的缺失則能?;ば∈竺庥詵⒄刮怪鞫雋?。

此研究提供了重要的機制證據,證明巨噬細胞衍生的netrin-1如何影響局灶性MMP3激活,干擾這些串擾的干預可能是腹主動脈瘤背景下未來藥物開發治療策略的基石。

 

研究思路

 

 

主要研究內容

 

1. Netrin-1在小鼠和人主動脈瘤中高表達,這可能在主動脈瘤中起致病作用。

構建小鼠主動脈瘤模型,研究主動脈病變部位內netrin-1的水平。定量RT-PCR(圖1a)與Western印跡(圖1b)均證實,與健康組織相比,人腹主動脈瘤中的netrin-1(Ntn1)表達顯著增加。這與小鼠組織(圖1c)/人類組織(圖1d)的主動脈切片免疫熒光染色結果一致。

 

圖1.Netrin-1在人和小鼠AAA中高度表達

(a. 定量RT-PCR;b. Western印跡;c/d. 小鼠和人的主動脈切片免疫熒光染色)

 

2. 造血譜系中的Netrin-1缺乏?;ば∈竺庥詵⒄刮怪鞫雋?/span>

利用胚胎肝臟移植策略建立Ntn1−/−ApoE−/− (Ntn1−/−→ApoE−/−)和Ntn1+/+ApoE−/− (WT→ApoE−/−)小鼠嵌合體,并輸注28天的AngⅡ或pBS。

WT→ApoE−/−小鼠有大部分具有主動脈瘤特征,而Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠相對較少(圖2b-d)。與健康小鼠相比,Ang II處理的WT→ApoE−/−小鼠血管擴張明顯增加,Ang II處理的Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠的主動脈直徑減?。ㄍ?f)。表明在造血室中netrin-1的缺失可以防止腹主動脈發展。炎癥和細胞外基質降解是腹主動脈瘤的關鍵標志,通過巨噬細胞浸潤和彈性蛋白損傷評估,結果觀察到netrin-1的表達可能導致彈性蛋白損傷并導致血管破裂(圖2g-i)。這些發現表明造血衍生的netrin-1在主動脈壁破壞中發揮重要作用。

 

圖2 造血譜系中的Netrin-1缺失防止AAA

(a. 促高血壓效應評估;b. 動脈瘤患病率;c/d. 嚴重性分層;e. 彩色多普勒超聲成像)

 

3. 主動脈巨噬細胞亞群中netrin-1的獨特特征

為確定造血譜系中哪個細胞負責netrin-1的表達,研究人員通過scRNA-seq分析小鼠腹主動脈瘤的轉錄組特征,發現約83%表達Ntn1的細胞為巨噬細胞(圖3c, d)。小鼠和人類的腹主動脈瘤切片的雙重免疫熒光染色表明,與注入PBS的健康小鼠相比,CD68陽性巨噬細胞中,netrin-1蛋白顯著存在(圖3e)。Ntn1富集的巨噬細胞是高表達促炎性和促血管生成標記的巨噬細胞,而含有較低水平Ntn1的巨噬細胞表現出高抗炎性巨噬細胞(圖3f)。表明巨噬細胞衍生的netrin-1在腹主動脈瘤中的致病作用。

 

圖3 巨噬細胞中的Netrin-1缺失抑制AAA的發展

(a. 患病主動脈中不同的免疫亞群;b. Ntn1在不同cluster的分布特征;c/d. 不同細胞種類表達Ntn1比例;e. 小鼠/人腹主動脈瘤切片的雙重免疫熒光染色;f. Ntn1水平與巨噬細胞種類;h-m. Ntn1flox/floxLysMcre+/− (Ntn1−/−Mø)和 Ntn1flox/floxLysMcre-/- Nnt1l−/− (WTMø)小鼠嵌合體模型)

 

4. 巨噬細胞中Netrin-1缺失抑制腹主動脈瘤的發展

研究人員又進一步建立Ntn1flox/floxLysMcre+/− (Ntn1−/−Mø)和 Ntn1flox/floxLysMcre-/- Nnt1l−/− (WTMø)小鼠嵌合體,并給小鼠注射單劑量的腺病毒(AAV)載體(圖3h-m)。觀察結果與用Ntn1−/−→ApoE−/−嵌合體一致,且表明巨噬細胞中缺乏netrin-1降低了發展為腹主動脈瘤的風險。

 

5. Netrin-1調節血管壁中MMP3的活性

Mmp3是一種關鍵的細胞外基質降解酶催化具有輔助炎癥特性的底物,研究人員對輸注Ang II的Ntn1−/−→ApoE−/−和WT→ApoE−/−小鼠分離的主動脈進行RNA測序發現mmp3基因在Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠主動脈中表達顯著下調(圖4b)。在Ntn1−/−Mø小鼠的主動脈切片中結果相同(圖4d)。這些均證明在腹主動脈瘤中,netrin-1能為MMP3的表達提供強有力的細胞外基質降解能力。

為了研究MMP3在腹主動脈瘤中的直接作用,研究人員在PCSK9AAV注射前攻擊Mmp3-/-小鼠,結果與WT小鼠相比,MMP3缺失顯著降低腹主動脈瘤和主動脈擴張的發生率(圖4h-4g)。在具有活性MMP3的WT小鼠血管壁中明顯存在廣泛的彈性蛋白降解,而MMP3缺失小鼠中具有完整的彈性蛋白纖維(圖4i)。

 

圖4 Netrin-1調節AAA中的MMP3活性

(Ntn1−/−→ApoE−/−和WT→ApoE−/−小鼠模型:a. 基因表達熱圖;b. Mmp3轉錄物表達的RNA-seq和RT-PCR驗證結果;c. 免疫熒光檢測MMP3蛋白表達。Ntn1−/−Mø小鼠模型:d. 免疫熒光檢測MMP3蛋白表達)

 

6. 巨噬細胞缺失的MMP3無法提供抗腹主動脈瘤的作用

巨噬細胞是動脈粥樣硬化病變中MMP3的重要來源, MMP3與患病主動脈中募集的CD68陽性巨噬細胞共定位(圖5a),重組netrin-1劑量依賴性地增加骨髓衍生巨噬細胞中MMP3酶活性(圖5b)。用WT或Mmp3-/-骨髓細胞建立WT→WT和Mmp3-/-→WT骨髓嵌合體來評估巨噬細胞衍生的MMP3在體內的作用,未觀察到兩組間發生率、腹主動脈瘤嚴重性及血管擴大的差異(圖5c, d)。表明netrin-1可在體外誘導巨噬細胞中MMP3的活性,但骨髓譜系中MMP3的缺失不足以在體內提供抗腹主動脈瘤的作用。

 

7. 血管平滑肌細胞衍生的MMP3加重腹主動脈瘤

Mmp3-/-小鼠具有抗AAA作用,而骨髓細胞中具有特異性MMP3缺失的小鼠發展為腹主動脈瘤,推測通過動脈壁內的駐留血管細胞的MMP3表達可能有助于AAA的發展。將小鼠原代VSMC于重組netrin-1以劑量依賴性方式顯著誘導MMP3的酶活性(圖5e),表明巨噬細胞衍生的netrin-1可以誘導VSMCs中的MMP3活性(圖5f)。

利用從WT小鼠分離的骨髓細胞建立WT→Mmp3-/-或WT→WT嵌合體,研究VSMCs衍生的MMP3是否可能有助于腹主動脈瘤的發病機制。結果顯示間質區室中MMP3的缺失保留了健康的彈性蛋白纖維,巨噬細胞來源的netrin-1驅動VSMCs中MMP3催化活性(圖5g-5k)。

 

圖5 MMP3有助于腹主動脈瘤發展

 

 

8. Netrin-1調節鈣內流,激活血管平滑肌細胞中的MMP3

進一步研究調節netrin-1依賴性對VSMCs中MMP3的影響的分子機制。發現netrin-1有效且快速地誘導VSMC中的細胞內Ca2+波(圖6a);在Ca2 +螯合劑存在下用netrin-1刺激VSMC減弱了MMP3活性的誘導(圖6b);在BAPTA存在下逆轉染色模式表明netrin-1誘導的NFATc3核轉位依賴于Ca2+(圖6c);在NFATc3抑制劑VIVIT肽存在下,netrin-1誘導的MMP3催化活性完全被消除(圖6d)。這些發現表明netrin-1通過同步VSMC中的Ca2+信號傳導來驅動MMP3活性的核心作用。

 

9. Netrin-1通過其在VSMC中的受體neogenin-1調節MMP3

研究netrin-1是否可以通過neogenin-1受體調節MMP3的表達,結果表明netrin-1選擇性激活neogenin-1觸發激活MMP3所需的信號級聯反應(圖6e-6g)。為了證明巨噬細胞衍生的netrin-1可以通過VSMC中的neogenin-1調節MMP3,在transwell中對巨噬細胞和VSMC進行了共培養測定。與活化的巨噬細胞共培養的VSMC中MMP3活性增加,而抗neogenin-1阻斷抗體的VSMC中MMP3活性顯著降低(圖6j)。結果進一步確定巨噬細胞衍生的netrin-1通過VSMC中的neogenin-1活化來調節的MMP3活性。

 

 

圖6 Netrin-1通過其受體neogenin-1動員Ca2+并驅動血管平滑肌細胞中的MMP3活性

 

參考文獻:

Tarik Hadi, Ludovic Boytard, Michele Silvestro,et al. 1Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells.201812.Nature communications(12.353)

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