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晶能九年,感恩同行丨表觀高分文章第一講 (scATAC-seq 助力果蠅胚胎發育研究)
發布日期:2019-03-13瀏覽:

本文在單細胞水平上研究胚胎發生過程中染色質的調節動態。使用sci-ATAC-seq方法,分析果蠅胚胎的20000多個單核的染色質可接近性。結果表明,一個共同的發育程序可以聯系到其他物種中的中內胚層譜系;確定了30075個具有組織特異性可接近性的遠端調節元件,驗證了預測的增強子亞群在轉基因胚胎中的胚層特異性。總之,研究結果證明了——在單細胞水平上研究胚胎能夠解決發育過程中染色質景觀的動態變化,及揭示后生動物胚層和細胞類型的順式調控程序。

 

 

研究思路

 

 

主要研究結果

1. 胚胎發育過程中染色質可接近性的異質性

使用sci-ATAC-seq來處理來自甲醛固定的果蠅胚胎的細胞核,將基因組劃分為2kb的窗口,并根據每個窗口中是否觀察到任何讀數對每個細胞進行評分。單個細胞中可接近性的測量分布稀疏,但數據的結構足以揭示具有相似染色質可接近性的細胞亞群(圖1a-c)。為了比對基礎調控元素,匯總每個時間點最大4-5個clade中的細胞數據,以調用每個‘in silico-sorted’ clade的可接近性峰值(圖1d)。結果揭示在胚胎發生過程中染色質可接近性的高度動態和異質性,與之前的時間點相比,在后期時間點識別出的差異可接近位點大約是其兩倍。

 

為確定每個細胞clade的類型,將可接近區域與3841個發育增強子和9356個基因啟動子比較,其中胚胎發生具有特異性的組織活性。6-8h和10-12h的四個主要分支對應三個主要的胚層,有兩個分區:外胚層,分為神經源性(clade1)和非神經原性(clade2)譜系;中胚層,將其分成肌源性中胚層(clade3)和非肌源性中胚層(如脂肪體和血細胞)與內胚層(clade4)組合(擴展圖1)。后者表明非肌源性中胚層和內胚層表現出相似的染色質可接近性,這表明共同的發育過程。

 

圖1  果蠅胚胎發育過程中染色質可及性的單細胞分析

擴展圖1 6-8h和10-12h LSI類的增強子富集

 

2.早期胚胎染色質可接近性的發育動態和空間異質性

應用t-SNE捕捉胚胎發育動態,細胞的密度峰聚類使得能夠在2-4h識別18個細胞簇(圖2a),這些簇為活性增強子和轉錄因子的相對富集分析顯示在其發育階段顯著差異(圖2b),發育軌跡將細胞分成三個主要分支,這與對主要胚層的注釋一致(圖2c)。

染色質可接近性反映了沿著胚胎前后(A-P)和背腹(D-V)軸的精制空間域中的增強子活性。兩種基因的前增強子在假定的前胚盤簇(cluster6和15)的細胞中具有更大的可接近性,而后增強子在推定的后胚盤簇(cluster4、7和16)中表現更大的可接近性(圖2e、2f)。表明sci-ATAC-seq可以鑒定細胞亞群中特異性可接近的調節區域,而不需要FACS分選;另外,這些早期的原腸胚前細胞命運事件是由染色質可接近性的空間異質性支持的。

 

圖2 早期胚胎染色質可及性的時間動態和空間異質性

 

3. 染色質可接近性推斷單個細胞類型

將t-SNE應用于后期時間點,在譜系定型(6-8h)和分化(10-12h)期間,顯示不同的細胞簇,可以很容易地觀察到特定組織或細胞類型(圖3a、3b)。一些小的簇被識別為由組合索引產生的可能 “碰撞”,因此被丟棄(圖3a、3b中的紫色簇);對于所有剩余的聚類,細胞類型分配與胚層clade分配大致一致(圖3c)。雖然低估了這些階段存在的細胞數量,但數據顯然不會偏向于任何特定的組織或細胞類型。

 

圖3.基于染色質可接近性將單細胞分配到組織、細胞類型

 

4. 預測的增強子在轉基因胚胎中的胚層特異性

為確定具有組織特異性染色質可接近性的元素是否與真正的組織特異性增強子相對應,測試了轉基因胚胎中31種元件。選擇在6-8h和/或10-12h顯示clade特異性可接近性的啟動子區域元件,其與先前表征的增強子不重疊。結果顯示:94%測試區域在體內起到發育增強子的作用;90%活性增強子在預測組織中顯示出活性,其中23個是該組織專有的(圖4)。由于卵黃是胚胎外的,表明卵黃和中胚層組織間存在著潛在的調節聯系,是由GATA轉錄因子在卵黃和非肌源性中胚層中的作用所支持的。

 

圖4 使用sci-ATAC-seq預測組織特異性增強子活性

結論

 

本文證明了sci-ATAC-seq不僅能夠闡明染色質可接近性的發展動態,而且能夠大規模預測體內增強子活性。通過結合每個t-SNE簇內細胞的讀數,生成了染色質可接近性的細胞類型特異性軌跡,揭示了細胞類型之間的大量差異。

一個擴展的數據集包括更多的每個時間點的細胞,涵蓋果蠅發育的全部過程,它有潛力識別更罕見的細胞類型,并揭示染色質可接近性景觀的完整連續視圖。另外,染色質狀態、轉錄輸出、譜系歷史和空間信息在單細胞分辨率下的整合有可能解開生物體基因組如何編碼其發育。

 

參考文獻

Cusanovich, Reddington, Garfield et al., The cis-regulatory dynamics of embryonic development at single cell resolution. Nature, published online 14 March 2018. DOI: 10.1038/nature25981.

 

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