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10x案例解析 | 單細胞測序助力果蠅衰老過程中細胞圖譜的繪制
發布日期:2019-08-30瀏覽:
10x Genomics單細胞轉錄組測序如火如荼,在探索復雜的大腦神經細胞中屢立戰功。
 
 
果蠅的大腦含有數百種不同類型的神經元和構成復雜網絡非神經元細胞。2018年,Cell發布了一篇由比利時魯汶大學的研究人員撰寫的文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain.”該研究首次繪制了果蠅衰老過程中的細胞圖譜。
 
研究思路:
 
 
主要研究結果:
 
●  成人果蠅大腦在衰老過程中的單細胞圖譜
●  網絡推斷揭示了大腦調節狀態與氧化磷酸化相關
●  盡管基因表達呈指數下降,但在衰老期間仍保留細胞身份
●  網上共享數據庫SCope的構建,用于探索和比較不同物種的單細胞數據集
 
 
結果詳解
 
01  果蠅大腦的細胞圖譜(10x Genomics單細胞RNA-seq)
經過數據質控分析得到高質量的細胞,對57k 個細胞進行無監督聚類,初步得到87個 clusters。依據cluster特異表達的基因與之前發表的已知細胞類型的marker基因對細胞進行鑒定,初步分為三大類神經元:24,802個(43.6%)膽堿能神經元 (VAChT)、13,296個(23.4%)谷氨酸能神經元 (VGlut)、6,177個(10.8%)GABA能神經元(Gad1)。按神經元和非神經元分為兩大類群。
 
 
 
 
接下來對細胞進行亞型細分和類型鑒定,如下:
神經元進一步細分亞型,通過marker基因識別細胞類型可鑒定:
●  serotonergic neurons(SERT)
●  octopaminergic/tyraminergic neurons(Tdc2)
●  dopaminergic neurons(PLE)
 
 
 
 
非神經元細胞細分亞型,通過marker基因識別細胞類型可鑒定:
●  星形膠質細胞(alrm)
●  皮質膠質細胞(wrapper)
●  血細胞(hml)
●  神經周膜(vmat)
●  神經外膜下膠質細胞(moody)
 
 
通過基因ey和prt識別KC細胞(蘑菇體(MB)是果蠅的學習和記憶中心,由Kenyon cells (KCs) 組成),通過組合多個marker基因對MB腦葉細胞細分亞型:α/β葉(sNPF)、α'/β'葉(trio)(并找到其新的marker基因DAT)、γ 葉(sNPF,trio)。利用組合多個marker基因的識別方法,作者還對視葉細胞進行了亞型細分,進一步鑒定多種神經元細胞。
 
 
 
 
 
綜上,利用上述方法,作者一共鑒定出87種大腦細胞類型,絕大部分是神經元細胞,還有少部分的非神經元細胞,如神經膠質細胞和血細胞。
 
 
 
作者還進一步評估了性別、年齡、基因型和生物學重復對細胞聚類和類型的影響,發現除了cluster23之外,所有cluster都有很高的重現性,基本沒有出現差異。
 
 
 
02  鑒定未被識別的稀有細胞類型
利用dFBR23E10-Gal4流式分選dorsal fan-shaped bodyneurons(dFB)細胞,并進行低通量的單細胞測序:R23E10-GFP分選dFB細胞→CEL-seq(22 cells)、smart-seq2(45 cells、34 cells),并結合10x Genomics測得的57k個高質量單細胞轉錄組數據進行映射,發現在87個cluster中,cluster61與目的分選的dFB轉錄組數據最匹配。對cluster 61進一步聚類分析得到7個細胞亞群。
 
 
 
 
 
也可以利用已發表明確的細胞亞型的轉錄組數據,與10x Genomics測得的單細胞數據結合分析,對細胞群進行亞聚類,進而鑒定難以識別的稀有細胞類群。如OPNs細胞亞型、多巴胺能神經元亞型、肽能神經元亞型等。
 
 
 
 
 
 
03  利用SCENIC繪制細胞間的調控網絡
利用SCENIC鑒定了150個TF,其motif顯著富集于共表達的基因集。使用基因調控網絡進行細胞聚類,得到不同于依據基因表達的聚類結果。發現這些細胞類型具有最特殊的TF網絡,如OPNs的TF網絡、視葉細胞的TF網絡等。
 
 
 
 
 
 
對于預測得到TF和motif,一是可以對TF進行GO富集分析,結合已發表的數據,與已發表的文獻信息比較進而間接求證;二是通過實驗直接驗證,作者通過Bulk ATAC-seq對預測的Onecut結合位點是否位于基因組中的開放染色質中進行實驗驗證,分析確定Onecut位點強烈富集ATAC-seq信號,其在許多神經元類型中具有廣泛的活性,即Onecut有特別強的泛神經網絡。
 
 
 
 
 
04  大腦調節狀態與氧化磷酸化預測
根據幾個關鍵的調控因子組合對神經元進行分類,大致可以將大腦中的神經元細胞分為三類,central brain A(Dati和Pros)、central brain B(Imp)、optic lobe(Scro)。比較這三類神經元的差異基因表達譜并進行GO富集分析,發現與中央腦A相比,在視神經葉和中央腦B中涉及與ATP代謝和氧化磷酸化相關基因的顯著上調(中央腦B的線粒體reads顯著增加),并利用mitoTimer實驗進行體內驗證。因此,作者推斷可以通過TFs的特定組合預測參與氧化磷酸化基因的表達水平。
 
 
 
 
 
 
 
05  衰老對細胞的影響
作者已評估了性別、年齡、基因型和生物學重復對細胞聚類和類型基本沒有影響,但發現衰老對細胞存在以下影響:其一,UMI數量和基因數量在衰老過程中呈指數下降,這種現象出現在所有神經元和神經膠質細胞中;其二,神經元和神經膠質的成分比例略有變化,神經膠質細胞隨年齡增長而相對增加;其三,細胞大小隨著年齡的增長而減小,這與mRNA含量的下降相一致。作者通過分析基因表達與年齡的相關性,與核糖體相關的基因在衰老過程中表達上調,參與氧化磷酸化的基因表達下調,利用這些特征基因對細胞進行年齡預測。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
總結:
 
作者利用10x Genomics單細胞平臺,對數萬個腦細胞進行聚類分析,尋找marker基因定義各類神經元和非神經元細胞類型,共發現了上百種大腦細胞,繪制了果蠅大腦老化過程中的神經系統圖譜,并探索構建了不同類型細胞之間的聯系。作者最后還創建了網上共享數據庫Scope,可以供其他學者探索大規模單細胞數據集的基因表達和基因調控分析,這類細胞圖譜研究為更好的理解大腦功能特征和疾病發展等做出了重大的科學貢獻。
 
參考文獻:
 
Davie K, Janssens J, Koldere D, et al. A Single-Cell TranscriptomeAtlas of the Aging Drosophila Brain. Cell. 2018;174(4):982-998.e20
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